聚糖唾液酸化對藥物的安全性和有效性很重要

在人類中，聚糖上的主要唾液酸是Neu5Ac，然而，Neu5Gc（其具有糖基而不是乙?；┛梢蕴砑拥皆诓煌毎抵斜磉_的糖蛋白中。這種非人Neu5Gc可引發(fā)免疫反應，其可導致生物制藥的炎癥和/或中和（因此失去功效）。聚糖的唾液酸化也會對藥物的藥代動力學特性產(chǎn)生重大影響：例如，具有末端半乳糖（不含唾液酸）的聚糖會被肝臟中的無唾液酸糖蛋白受體從循環(huán)中去除。糖蛋白，如EPO，可能含有額外乙酰化的唾液酸（如Neu5,9Ac2），這可能會影響藥物療效。唾液酸化對受體結(jié)合和信號轉(zhuǎn)導也很重要；例如，IgG-Fc聚糖上唾液酸的存在降低了ADCC（抗體依賴性細胞毒性）活性并具有抗炎作用。

唾液酸的鑒定和定量：

a）DMB唾液酸標記試劑盒（Cat#D491322），通過（U）HPLC分析釋放、鑒定和獲得Neu5Ac、Neu5Gc和Neu5,9Ac2的相對定量。我們使用熒光標記DMB來特異性標記唾液酸，然后使用（U）HPLC結(jié)合熒光檢測來檢測和定量唾液酸（見圖1）。使用熒光標記使測定比PAD更敏感。由于DMB標簽僅在標記唾液酸（跨越2個相鄰的酮基）時才變?yōu)闊晒?，這種特異性還克服了樣品緩沖液中其他成分引起的問題（這可能與PAD檢測有關(guān)）。

b） 糖蛋白上Neu5Ac和Neu5Gc的絕對量也可以通過與Ludger定量標準（Cat#B491176、B491217）進行比較來確定。

c） 建議使用定量唾液酸化糖肽標準品來檢查聚糖釋放、標記和回收的效率。

圖1：來自唾液酸參考面板的DMB熒光標記唾液酸（通過輕度酸水解釋放）的RP-HPLC分析。此參考面板是D491322套件的一部分。

唾液酸化聚糖的分析和表征

N-聚糖通過PNGase F（Cat#P420186）從生物制藥中去除。使用含有2-吡啶硼烷還原劑的LudgerTag試劑盒，用2AA或2AB熒光標記聚糖，并使用濾筒清潔。

a） HILIC-（U）HPLC分析提供了GU值，可與數(shù)據(jù)庫和標準GU值匹配，以獲得初步結(jié)構(gòu)分配。

b） 外糖苷酶測序后的進一步分析可用于表征存在的結(jié)構(gòu)（圖2）。例如，在用唾液酸酶（Cat#N489858）消化后消失（或減少）的峰將含有唾液酸化結(jié)構(gòu)。

圖2：EPO的外糖苷酶測序；2AB標記的聚糖在LudgerSep-N2柱上運行酶特異性：a3Sialic=1-3唾液酸；a36唾液酸＝1-3和6唾液酸；Fuc＝1-6巖藻糖；bGal＝b1-4半乳糖；GlcNAc=b1-2,4,6 N-乙酰氨基葡萄糖。

c） 在弱陰離子交換（WAX）柱上標記的聚糖的電荷分離可以提供關(guān)于單唾液酸化聚糖、二唾液酸化聚糖和四唾液酸化聚糖的相對比例的數(shù)據(jù)。（圖3）。

圖3:柱上2AB標記聚糖的弱陰離子交換（WAX）-HPLC電荷分離。頂部痕量（紅色）：胎球蛋白N-聚糖。底部痕量（藍色）：EPO N-聚糖

對于復雜的混合物，這些不同電荷的部分可以通過 HILIC-(U)HPLC 和外切糖苷酶測序進一步分離和分析，以充分表征結(jié)構(gòu)（圖 4）：

圖4：通過WAX-HPLC和HILIC-UPLC對EPO N-聚糖進行電荷分級。

d） 質(zhì)量組成數(shù)據(jù)可通過甲基化后的MALDI分析獲得，以穩(wěn)定唾液酸（圖5）。

圖 5：全甲基化 EPO N-聚糖的 MALDI 分析